与初次接触ELISA实验的老师交流时，我们经常收到这样的提问：我的样本已经准备就绪，是不是可以直接按照说明书的步骤上样检测了呢？

遇到这样的情况，我们通常会建议老师先取部分样本进行预实验。对于市面上售卖的商品化ELISA试剂盒，明明实验条件和实验流程都已经确定，为什么需要进行预实验？下面由小欣为您讲解ELISA预实验的必要性。

进行ELISA预实验的必要性

✍ 掌握实验流程：

不同的商品化ELISA试剂盒可能有不同的实验流程和操作要求，不可根据先前的实验习惯随意改动；进行预实验有助于实验者熟悉整个实验流程，减少操作失误。

✍ 实验方案优化：

预实验可以帮助实验者记录和分析实验过程中的问题，以便与供应商沟通，优化实验方案，确保正式实验有序进行。

✍ 样本量预测与稀释倍数确定：

商业化的试剂盒在生产过程中会进行一系列的验证测试，以确保其对不同样本类型的适用性。然而，由于试剂盒制造商能够获得的样本类型有限，实验者的样本造模情况不一，实际用于检测的样本可能会受到多种因素的影响，如组织类型、提取方法和刺激处理方式的影响，或是细胞状态、细胞数量、采样时间和细胞刺激方式的影响等。因此，在正式实验前，实验者需要通过预实验来预测样本中待测物质的含量，并据此确定最佳的样本稀释比例。

预实验有助于确定样本的最适稀释倍数，以适应ELISA试剂盒的标准曲线，避免因样本中待测物质浓度过高超出标准曲线，导致数据无法使用；同时，也避免因样本中待测物质浓度过低，上样后读数低于所用ELISA试剂盒检测限，浪费样本与试剂。

✍ 实验方法验证：

确保所采用的实验方法准确可靠，减少实验误差，提高实验结果的重复性。

那么，如何设计和进行一个有效的预实验呢？除了按照厂家提供的说明书进行操作之外，ELISA预实验也需要关注一些额外的注意事项。

✍ 精选具有代表性的样本以优化实验设计：

在预实验中，应根据样本的性质（如造模方式）和需求，选择具有代表性的样本，例如理论上靶标物含量最低和最高的样本，以确定正式实验中样本OD值的读数情况。

✍ 确定理想的稀释比例：

对样本进行梯度稀释，根据样本中目标生物标志物的浓度（可参考如文献、先前的实验结果等），进行梯度稀释上样，如按照2倍、5倍或10倍的稀释比例上样，并同时测试标准品。标准品的制备应遵循试剂盒说明书的指导，如果试剂充足，可以选择构建一个完整的标准曲线；如果试剂有限，也可以选择几个关键浓度点（如：空白孔、最低浓度孔、中间浓度孔和最高浓度孔）构建标曲。

将不同稀释浓度的样本的OD值与标准品的OD值进行比较，理想的稀释比例应能够使稀释后所有或大多数样本的OD值位于标准曲线的最佳拟合区域。需要注意的是，在进行预实验时必须设置标准曲线，以此为参考标准来确定理想的稀释比例。

通过预实验，实验者可以对ELISA实验的条件进行初步探索和优化，也能及时发现并解决实验中的问题，提高正式实验的准确性和可靠性。