经典的和非经典的炎症小体通路中均通过活化下游的蛋白酶，切割底物蛋白gasdermin D (GSDMD)诱导细胞焦亡。caspase-1加工处理IL-1β和IL-18使其成熟 , 而脂多糖激活的caspase-4、5和11细胞因子靶点仍待研究。近期，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院邵峰实验室与中科院生物物理所丁璟珒实验室团队在Nature（IF=64.8）上发表题为“Recognition and maturation of IL-18 by caspase-4 noncanonical inflammasome”的研究，发现白介素-18(IL-18)是半胱氨酸蛋白酶caspase-4/5的生理底物，并解析了caspase-4与IL-18复合物的精细三维结构，详细阐明了天然免疫通路中caspase-4/5特异识别和活化IL-18的分子机理。

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在该项研究中，使用了欣博盛生物（NeoBioscience Technology Co, Ltd）的QuantiCyto® Human IFN-γ ELISA kit与QuantiCyto® Human IL-18 ELISA Kit，用于检测细胞培养上清中相关蛋白的含量。

研究详情

经典炎症小体（inflammasome）通路通过活化下游的蛋白酶caspase-1，切割底物蛋白GSDMD（gasdermin D）释放其N端结构域，在细胞膜上寡聚成孔，激活细胞焦亡的免疫应答。非经典炎症小体（noncanonical inflammasome）通路中，天然免疫受体caspase-4/5以及小鼠的同源蛋白caspase-11，可以直接识别革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）寡聚激活，通过切割共同的底物蛋白GSDMD介导细胞焦亡发生。非经典炎症小体通路还广泛存在于许多非免疫细胞中，表明其重要的免疫防御功能。除了GSDMD，活化的caspase-1还能切割IL-1β和IL-18，成熟形式的IL-1β与IL-18通过GSDMD在细胞膜上形成的孔道分泌至胞外，发挥促炎性的生理功能。相比caspase-1，Caspase-4/5/11已知的生理底物只有GSDMD，是否存在其他天然免疫底物并不清楚。

研究团队发现，在细胞内由LPS激活的caspase-4能够高效地切割Pro-IL-18，将成熟的IL-18细胞焦亡释放到细胞外周中，进而发挥其作为经典促炎症细胞因子的生理功能。实验表明， caspase-4只能特异性切割Pro-IL-18。非经典炎症小体通路活化IL-18的现象并非人类特有，其它高等哺乳动物（如猪、兔子等）也能在caspase-4被激活后进行Pro-IL-18加工和活化。

研究团队通过体外实验证明重组表达的活性形式caspase-4能够高效地切割Pro-IL-18，其切割位点和caspase-1完全一致。有趣的是，小鼠的Pro-IL-18具备切割所须的、与人完全相同的四肽序列LESD，但人的caspase-4不能有效切割小鼠Pro-IL-18，这一发现暗示除了四肽序列之外，caspase-4切割Pro-IL-18还需要另外的特异性识别位点。

为了揭示caspase-4特异性识别Pro-IL-18的分子机制，研究团队尝试解析caspase-4与Pro-IL-18复合物的晶体结构，多轮尝试均未获得晶体。邵峰实验室的前期工作中发现痢疾杆菌(Shigella)分泌的效应蛋白OspC3可以特异识别宿主细胞内的caspase-4，通过催化caspase-4酶活中心的关键精氨酸发生一种全新的ADP-riboxanation翻译后修饰进而使caspase-4失活(Hou et al., 2023 , Li et al., 2021)。研究团队在先前研究的基础上发现OspC3能够稳定caspase-4与IL-18复合物，促进其结晶。通过加入OspC3ARD，研究团队成功解析了OspC3ARD-caspase-4-Pro-IL-18的三元复合物的高分辨率晶体结构。

该三元复合物以2:2:2的形式呈现，其中caspase-4-p20/p10二聚化形成四聚体，两端分别与Pro-IL-18相结合，而OspC3ARD位于caspase-4-p20的侧面，起到稳定三元复合物的作用。在该高分辨率复合物结构中，Pro-IL-18的LESD四肽序列深入caspase-4的酶活中心，与caspase-4酶活中心结合，形成第一个作用界面。此外，caspase-4-p20-C末端的loop区和另一个caspase-4-p10-N端的loop区形成一个分子间的β折叠，这个β折叠独立于caspase的酶活中心，与Pro-IL-18结合，构成第二个相互作用界面。Caspase-4 通过这两个相互作用界面来识别IL-18。

图 1 ：OspC3ARD-caspase-4-Pro-IL-18三元复合物的分子结构

OspC3ARD-caspase-4-Pro-IL-18三元复合物的结构首次揭示了Pro-IL-18精细的结构特征。Pro-IL-18在被caspase-1/4/5切割后，将发生巨大的构象变化和局部发结构重排，重新折叠产生新的β-发夹与α-螺旋结构，而这些新产生的二级结构对于IL-18结合其受体IL-18Rα至关重要，是IL-18发挥生理功能的必需结构。这个结果也从结构层面解释了pro-IL-18无法结合IL-18Rα的原因。结构比对发现，caspase-4识别Pro-IL-18的关键残基在caspase-11上不保守，将caspase-11上关键残基突变与替换后，可以使其具备与caspase-4相当的加工Pro-IL-18的能力。这个结果也从侧面证明了caspase-4-Pro-IL-18复合物结构的准确性。

研究团队开展的这项工作发现并证明了炎症因子IL-18是非经典炎症小体通路活化的caspase-4/5的生理底物，揭示了天然免疫通路中caspases-4/5-IL-18这条通路在众多细胞种的存在，以及Pro-IL-18被加工后成熟为有生理功能的炎症因子的分子机制，为caspase的酶活机制与底物识别机制、天然免疫和适应性免疫的联系提供了全新的理解。

在临床上，血液中高水平的IL-18与多种自身免疫疾病相关，如特异性皮炎、炎症性肠病与幼年特发性关节炎等，这项工作将为理解这些自身免疫疾病的发生机制以及开发新的干预策略提供新的思路。

图 2 ：Caspases特异识别与切割IL-18的精确分子机制

文献引用

SHI X, SUN Q, HOU Y, et al. 2023. Recognition and maturation of IL-18 by caspase-4 noncanonical inflammasome. Nature [J].

（原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-023-06742-w）

1. HOU Y, ZENG H, LI Z, et al. 2023. Structural mechanisms of calmodulin activation of Shigella effector OspC3 to ADP-riboxanate caspase-4/11 and block pyroptosis. Nat Struct Mol Biol [J], 30: 261-272.

2. LI Z, LIU W, FU J, et al. 2021. Shigella evades pyroptosis by arginine ADP-riboxanation of caspase-11. Nature [J], 599: 290-295.

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