QuantiCyto®ELISA基于双抗体夹心法开发，利用两种抗体（捕获抗体和检测抗体）协同测定样本中抗原的含量。

以下提供QuantiCyto®ELISA试剂盒的完整使用方案。

实验材料准备

实验所需材料

欣博盛生物所提供的所有QuantiCyto®ELISA试剂盒中包含完成整个实验所需的试剂，方便您的实验所需。

自备实验器材与耗材

1. 酶标仪(450 nm波长滤光片)

2. 进口品牌高精度加液器及一次性吸头：0.5-10 ul, 2-20 ul, 20-200 ul, 200-1000 ul。

3. 37 °C恒温箱, 双蒸水或去离子水，吸水纸等。

标本收集

作为ELISA实验准备步骤的重要环节之一，样本收集与处理的好坏，可能直接影响实验的成功率与数据的准确性。

可用于ELISA实验的样本一般为血清、血浆、细胞培养上清以及细胞裂解液、组织匀浆等，不同样本有针对性的预处理方法。由于ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量，因此样本处理的原则为清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。

关于标本收集过程的详细建议，请查看我们的站内文章“ELISA样本处理”或查看来自各大高校、研究所的科研人员的实验建议。

检测前准备工作

试剂盒平衡

提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

标准品处理

开盖前1000rpm离心1min。按说明书推荐体积加入标准品&标本通用稀释液至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀。根据说明书推荐标准曲线进行稀释。

其他工作液组分制备

洗涤液：实验开始前，用双蒸水将浓缩洗涤液稀释为1×工作液。未用完的放回4 °C

生物素化抗体工作液：按当次检测所需用量，于使用前20分钟，用生物素化抗体稀释液将浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液。

酶结合物工作液：按当次检测所需用量，于使用前20分钟，用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物稀释成1×工作液。

实验操作

1.    从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4 °C。

2.    空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100 ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37 °C恒温箱，避光孵育90分钟。

3.    提前20分钟准备生物素化抗体工作液。

4.    洗板5次。

5.    空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 °C恒温箱，避光孵育60分钟。

6.    提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 °C)放置。

7.    洗板5次。

8.    空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100 ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37 °C恒温箱，避光孵育30分钟。

9.    打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

10.    洗板5次。

11.    加入显色底物(TMB)100 ul/孔，37 °C恒温箱，避光孵育15-30分钟，通常可根据孔内的反应颜色来判定何时终止反应，一般标曲的孔呈明显梯度时即可终止。

12.    加入反应终止液100 ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。

13.    在仪器保存读数结果。实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。

• 具体产品实验步骤可能存在差异，请以实际说明书中的操作步骤为准。

• 建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。

数据处理

读取并保存数据后，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，使用软件绘制并选取最佳拟合曲线，推荐使用二次多项式方程拟合。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

关于数据处理的详细建议，请点击查看我们网站的文章内容“ELISA数据处理”。